TÉCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
3.1 GENERALIDADES
Conjunto de técnicas que
permiten el cultivo de las células y
tejidos vegetales en condiciones axénicas y el aprovechamiento de su
totipotencia, así como de su aptitud para la variación y capacidad de
modificación genética
CULTIVO DE PLANTAS IN VITRO
REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS Y TEJIDOS
VEGETALES
DESARROLLADO EN UN AMBIENTE DONDE NO HAY NINGÚN OTRO ORGANISMO VIVO
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
TRABAJO SON
TOTIPOTENCIA
CAPACIDAD DE REGENERACIÓN DE UNA PLANTA ENTERA A PARTIR DE
UNA CÉLULA O UN GRUPO DE
ORGANOGÉNESIS ADVENTICIA
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
3.2 MICROPROPAGACIÓN
Permite el crecimiento y
desarrollo de material vegetal en recipientes que lo separan del ambiente exterior
y lo mantienen en condiciones controladas y asépticas. Entre las diversas técnicas
de cultivo in vitro, la micropropagación consiste en la producción clonal de
vegetales a partir generalmente de ápices o explantos nodales de una planta
madre.
ETAPAS DE LA
MICROPROPAGACIÓN
Un programa de micro
propagación puede contender en las siguientes etapas:
1.- desinfección de las
yemas de las plantas o desinfección de semilla
2.- introducción del
material seleccionado in vitro
3.- Multiplicación de brotes
4.- Enraizamiento.
5.- Aclimatación.
Esta técnica tiene numerosas aplicaciones.
La multiplicación de plantas:
Micropropagación
La mejora sanitaria: Microinjerto
La mejora genética: Incremento de variabilidad genética
Método
haplodiploide
Transformación
genética
3.3 Plantas
libres de patógenos
Es de gran utilidad para obtener altos
rendimientos en cultivos de propagación vegetativa. El proceso pasa por dos
etapas bien definidas, la primera es la etapa de laboratorio y la segunda es la
etapa de invernadero. Ambas están estrechamente relacionadas, ya que para poder
propagar plantas en invernaderos se debe contar con material procedente de
cultivo de tejidos de laboratorio. La propagación en invernaderos se
caracteriza por que la propagación de las plantas que se instalan se realiza en
un ambiente protegido del ingreso de insectos vectores trasmisores de virus,
además de otras plagas. De igual modo el uso de sustrato desinfectado permite
una propagación libre de patógenos y el uso de plántulas libres de virus
procedentes de propagación ‘in vitro’.
3.4. TÉCNICAS IN VITRO
APLICADAS AL FITOMEJORAMIENTO
Cultivo de anteras:
Mediante esta
técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de
desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar
embriones o callo. Transferidos éstos a medios de regeneración, se forman
plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles,
pero en algunas especies ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en
las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta.
Condiciones que afectan el cultivo de anteras:
-Genotipo de las
plantas donantes.
El genotipo es
quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. La capacidad
genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada
y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes
específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de
plantitas.se demostró que ambos rasgos eran altamente heredables, lo que
sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la selección.
-Albinismo.
Aunque no se ha
comprendido plenamente el fenómeno, hay pruebas de que el albinismo está
relacionado con la supresión del ADN de los plásmidos. Usar plantas híbridas
como donantes de anteras se considera un método práctico para aumentar el
número de plantas productoras de polen.
Pretratamiento de
las anteras
El tratamiento de
las anteras con temperatura baja o alta, con choque osmótico, o con otros
estímulos tiende a aumentar la producción de plantitas de polen.
El cultivo de
anteras aplicado al fitomejoramiento
El potencial que
posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de las células
del polen. Las células del polen de los híbridos F1 contienen
la dotación genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas
según las proporciones mendelianas. Estas células son haploides y permiten por
ello al mejorador selecciones eficazmente los recombinantes deseables; además,
una vez duplicadas esas células, se establecen rápidamente líneas
homocigóticas.
Ventajas del cultivo de anteras:
A) Obtención
de haploides duplicados a partir de híbridos F1 puede ser útil
para desarrollar variedades en forma fija en una estación central, con el fin
de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y de ensayarlas en ellos.
B) Crear
y acrecentar reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los principales
cultivos.
“Cultivo de óvulos”
El cultivo de
óvulos se ha usado para rescatar embriones derivados de cruzamientos
interespecíficos. Ha sido útil también para rescatar híbridos intergenéricos, y
para rescatar embriones abortados en uvas sin semillas.
Factores que
afectan el cultivo
Placenta: la
velocidad del desarrollo embrionario en los cultivos de óvulos se puede
aumentar, algunas veces, por medio del cultivo de óvulos con la placenta
todavía adherida a ellos.
3.4.2. VARIACIÓN SOMACLONAL
La variación
somaclonal es la variación genética o epi genética que se genera durante el
cultivo in vitro de plantas (cultivos celulares de tejidos u órganos) que
provenga de células somáticas. En programas de mejoramiento genético, la
variación somaclonal puede constituirse en un recurso importante que genera
variabilidad. Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de
germoplasma in vitro, este tipo de variación es indeseable. En vista de lo
anterior, se han utilizado una serie de técnicas moleculares para su detección.
3.4.3 FUSIÓN DE PROTOPLASTOS
Es una técnica
de biotecnología en la cual se
produce la fusión de las membranas de dos o más células dando lugar a un híbrido somático. La técnica es
ampliamente empleada para introducir variabilidad en las cepas de interés biotecnológico. Típicamente
se realiza mediante protoplastos vegetales, esto es, células vegetales
desprovistas de pared celular, si bien también puede efectuarse empleando otros taxones, como algunos hongos.
En biotecnología vegetal, la fusión de
protoplastos se emplea en programas
de mejora; un ejemplo es la generación de poliploides,
generalmente más productivos. Para ello la metodología consiste en aplicar
pulsos eléctricos a células en suspensión (electroporación) o inducir la
desorganización de las membranas empleando polietilenglicol.
Esta técnica, pese a mezclar el contenido genético de dos líneas distintas, no
está considerada ingeniería
genética, pues en su ejecución no se emplea la tecnología del ADN recombinante.
3.4.3 LAS APLICACIONES
AGRONÓMICAS SON:
ü Mejora
genética.
ü Propagación
masiva.
ü Plantas
libres de patógenos
ü Conservación
del germoplasma.
ü Metabolitos
secundarios.
ü Investigación.
3.5. CONSERVACIÓN IN VITRO
3.5.1. ASPECTOS IMPORTANTES
3.5..1.1 REGENERACIÓN
La regeneración de plantas enteras basada en los sistemas de cultivo de
células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo
in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemas
preformados. la regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es
muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de multiplicación y produce
porpágulos que poseen eje de raíz y de yema. Los embriones somáticos pueden
desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos más
estables.
3.5.1.2 VARIABILIDAD
La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar
sistemáticamente. Las características más importantes que se evalúan en el
almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas
son: contaminación, senescencia de la hoja (la razón hojas verdes/hojas
muertas), número de brotes verdes (para micropropagación adicional), número de
nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia
o ausencia de raíces, y ocurrencia de callo.
3.5.1.3 ESTABILIDAD
GENÉTICA
Los sistemas de cultivo de tejidos presentan diferentes niveles de
riesgo de variación genética. Igualmente, entre las dos estrategias de
conservación in vitro –el crecimiento lento y la crioconservación- hay
posibilidades de variación debidas a la posible regeneración de yemas
adventicias.
3.5.1.4 ESTRATEGIAS
Si bien este método ofrece la posibilidad de conservar germoplasma a
corto y mediano plazo en un espacio más reducido y a menor costo en relación
con las colecciones a campo, existe el riesgo de pérdida de las entradas por
contaminación accidental, error humano y /o por variación somaclonal y los
costos de las labores por mantenimiento son altos.
La crioconservación, es decir el almacenamiento de material biológico a
temperatura ultra baja, generalmente la del nitrógeno líquido (-196ºC), es la
única técnica actualmente disponible que asegura la conservación a largo plazo
del germoplasma vegetal.
La
crioconservación es una herramienta de conservación ex situ que se emplea con
éxito en numerosas especies vegetales tanto de interés agrícola como
amenazadas. Existen diversas técnicas para poder llevarla a cabo tales como la
vitrificación, encapsulación-desecación o vitrificación en gota entre otras. La
selección de una técnica en concreto dependerá de cada especie. Además, es
incluso necesario, optimizar para cada genotipo las diferentes etapas que
comprende el protocolo de crioconservación (precultivo, deshidratación,
congelación, descongelación…) con el fin de obtener una alta tasa de
recuperación post-descongelación. También cabe comentar que la
aclimatación al frío puede resultar una estrategia útil para mejorar la
respuesta del material a la crioconservación.
3.5.2 CRYOCONSERVACIÓN DEL GERMOPLASMA
Las técnicas del cultivo in vitro de tejidos aparecen en la actualidad
como una alternativa interesante para la conservación y el intercambio de
germoplasma; además, son las técnicas obligadas para la conservación de valiosos
genotipos derivados de la ingeniería y la manipulación de protoplastos, células,
o callos, siempre y cuando se consiga su regeneración como plantas enteras. Si
bien la conservación del germoplasma puede lograrse mediante el cultivo de
diferentes explantes, el de meristemas es el más adecuado por las siguientes
razones:
Las probabilidades
de ocurrencia de cambios genéticos son menores Dentro de cierto límites,
el germoplasma conservado está libre de patógenos Los meristemos son
frecuentemente explantes adecuados para la micropropagación
BIBLIOGRAFIA:
